目的参柏:对参柏洗剂原有定性和定量方法进行标准提高研究。方法:在原标准定性方法基础上,洗剂增加苦参碱和氧化苦参碱、质量盐酸小檗碱对照品鉴别及地骨皮薄层色谱鉴别;增加高效液相色谱法测定方中君药苦参所含有效成分苦参碱和氧化苦参碱含量。标准结果:薄层色谱法定性鉴别中,提高苦参、研究苦参碱、参柏槐定碱、洗剂黄柏、质量盐酸小檗碱、标准地骨皮斑点清晰且对应良好,提高阴性无干扰;苦参碱和氧化苦参碱分别在0.545 μg~5.45 μg(苦参碱r=0.99988)、研究0.2226 μg~2.226 μg(氧化苦参碱r=0.99993)浓度范围内,参柏与色谱峰面积线性关系均良好;苦参碱平均回收率99.27%(n=9),洗剂RSD为2.11%、质量氧化苦参碱平均回收率103.07%(n=9),RSD为1.68%。结论:本研究所完善、建立的定性和定量分析方法简便,重复性好,准确可靠,可用于参柏洗剂的质量控制。
参柏洗剂为我院多年的经验方,主要是由苦参、黄柏、地骨皮等中药制成的洗剂,具有清热祛湿,杀菌止痒的功效,临床上主要用于湿疹、癣、疥疮及虫咬皮疹。苦参具有清热燥湿、杀虫等功效,在方中为君药,主要用治湿疹、湿疮、皮肤瘙痒、疥癣麻风等病症,是许多外用复方制剂的重要组成药味。苦参主要含有生物碱类、黄酮类、脂肪酸类、苯丙素类等多种成分,其中生物碱类和黄酮类是其主要药理活性成分。生物碱主要含有苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱等,具有抗炎镇痛、抗菌、抗心律失常、抗肿瘤、抗病毒等多方面药理作用。黄柏具有清热燥湿,解毒疗疮的功效,可用治湿疹湿疮,疮疡肿毒。黄柏主含生物碱和黄酮类成分,其中生物碱类成分含量最高,是其主要有效成分,以盐酸小檗碱含量最高。黄柏在皮肤科疾病治疗方面应用广泛,有抗炎抗菌、抗过敏和抗氧化、抗痛风等作用,在方中为君药。地骨皮在方中为臣药,主含生物碱、有机酸及其酯类、蒽醌类等化合物,药理研究表明其具有降血压、降血糖、降血脂、抑菌抗炎等作。参柏洗剂现行标准鉴别项中只用了苦参、黄柏对照药材鉴别,无含量测定项,缺乏定量控制指标。为提升和完善该制剂质量标准,确保临床用药的安全、稳定,本研究拟采用薄层色谱法增加苦参碱、槐定碱、盐酸小檗碱的对照品鉴别和臣药地骨皮的对照药材鉴别;增加主要药理活性成分苦参碱和氧化苦参碱含量测定方法。
1实验器材
1.1仪器
澳华HH-2恒温水浴锅(常州金坛良友仪器有限公司);RE-52AA型旋转蒸发仪(上海科兴仪器有限公司);卡玛ATS4自动点样器(瑞士CAMAG公司);卡玛TLC成像系统(瑞士CAMAG公司);双杰JJ500电子天平(常熟市双杰测试仪器厂);TLE-204梅特勒托利多分析天平(瑞士梅特勒托利多公司);安捷伦高效液相色谱仪(型号:1260/1200,美国安捷伦公司)。
1.2材料
苦参对照药材(121019-201407)、苦参碱(110805-200306)、氧化苦参碱(110780-201007,以92.3%计)、槐定碱(110784-201706)、黄柏对照药材(121510-201606)、盐酸小檗碱(110713-201613)、地骨皮对照药材(121087-201707),均购买自中国食品药品检定研究院。参柏洗剂(250 mL/瓶,批号分别为20190102、20191103、20200501),均由广东省第二中医院药剂科制剂室生产提供。乙腈、乙醇为Merck色谱纯试剂,液相用水为屈臣氏饮用水,三氯甲烷、浓氨试液、甲醇等其他试剂为分析纯。
2 TLC法定性鉴别
2.1苦参定性鉴别
取参柏洗剂20 mL,加浓氨试液调节溶液呈碱性后,用三氯甲烷振摇提取2次,30 mL/次,合并两次三氯甲烷提取液,回收溶剂至干,残渣加1 mL三氯甲烷溶解,制得供试品溶液;另外取苦参对照药材1.00 g,加水100 mL,煮沸并保持微沸30分钟,煎液浓缩至约20 mL,自“加浓氨试液调节溶液呈碱性后”起,同法制成苦参对照药材溶液;再取苦参碱、槐定碱对照品适量,加无水乙醇分别制成每1 mL各含0.5 mg的对照品溶液;按照参柏洗剂处方比例和工艺,制得苦参阴性样品,再按供试品溶液制备方法操作,制得苦参阴性对照溶液。依照《中国药典》2015版通则薄层色谱法指导原则[21]操作,吸取上述参柏洗剂供试品溶液、阴性对照溶液各5 μL、苦参对照药材溶液10 μL、对照品溶液各10 μL,分别点样在2%氢氧化钠溶液制备的硅胶G碱板上,使成条带状,配制甲苯-丙酮-甲醇体积比为(16∶6∶1)的展开剂,展开至约8 cm,取出展开后的薄层板,晾干,再配制甲苯-甲醇-乙酸乙酯-水体积比为(4∶4∶8∶2)的溶液,在10 ℃以下放置使之分层,再取上层溶液作为展开剂,展开,将薄层板晾干,用碘化铋钾试液作为显色剂。结果显示,参柏洗剂供试品色谱图中,在与苦参碱对照药材色谱和苦参碱及槐定碱对照品色谱图对应Rf值处,斑点均对应良好,且苦参阴性无干扰,见图1。
2.2黄柏定性鉴别
取苦参鉴别项下供试品溶液作为黄柏鉴别供试品溶液。另取黄柏对照药材0.10 g,加水100 mL,煮沸并保持微沸30min,煎液浓缩至约20 mL,自“2.1”项下“加浓氨试液调节溶液呈碱性后”起,同法制成黄柏对照药材溶液;再取盐酸小檗碱对照品适量,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的对照品溶液;按照参柏洗剂处方比例和工艺,制得黄柏阴性样品,再按供试品溶液制备方法操作,制得黄柏阴性对照溶液。依照《中国药典》2015版通则薄层色谱法指导原则[21]操作,吸取上述参柏洗剂供试品溶液、阴性对照溶液、对照品溶液各1 μL、黄柏对照药材溶液2 μL,分别点样在硅胶G薄层板上,使成条带状,配制乙酸乙酯-冰乙酸-甲酸-水体积比为(15∶1∶1∶2)的展开剂[21],展开并晾干,置波长为365 nm的紫外光灯下观察。结果显示,参柏洗剂供试品色谱图中,在与黄柏对照药材和盐酸小檗碱对照品色谱图对应Rf值处,显相同的亮黄色荧光斑点,且黄柏阴性无干扰,见图2。
2.3地骨皮定性鉴别
取苦参鉴别项下的供试品溶液作为地骨皮鉴别供试品溶液。另取地骨皮对照药材1.00 g,加水100 mL,煮沸并保持微沸30min,煎液浓缩至约20 mL,自“2.1”项下“加浓氨试液调节溶液呈碱性后”起,同法制成地骨皮对照药材溶液;按照参柏洗剂处方比例和工艺,制得地骨皮阴性样品,再按供试品溶液制备方法操作,制得地骨皮阴性对照溶液。依照《中国药典》通则薄层色谱法指导原则[21]操作,吸取上述参柏洗剂供试品溶液、阴性对照溶液、地骨皮对照药材溶液各5 μL,分别点样在硅胶G薄层板上,使成条带状,配制甲苯-丙酮-甲酸体积比为(10∶3∶0.3)的展开剂,展开并晾干,置波长为365 nm的紫外光灯下观察。结果显示,参柏洗剂供试品色谱图中,在与地骨皮对照药材色谱图对应Rf值处,显相同的蓝色荧光斑点,且地骨皮阴性无干扰,见图3。
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